La corona spagnola finanziò a Vespucci (1454-1512) un secondo viaggio nel 1499. Con tre navi di conserva, una capitanata nuovamente da Juan de la Cosa (ca.1460-1510), Vespucci salpò da Cadice il 16 maggio facendo rotta per le Canarie. La flotta proseguì senza scalo fino alle isole di Capo Verde, dove fece rifornimento di acqua e legna all'isola di Fogo. Da qui, proseguendo verso Libeccio, Vespucci navigò per quarantaquattro giorni percorrendo cinquecento leghe e toccando terra a 5° di latitudine sud, nella Guyana francese. Convinto di trovarsi sulle coste occidentali dell'Asia, Vespucci iniziò a navigare lungo la costa in direzione sud-est con l'intenzione di doppiare il Capo Cattigara. Le forti correnti contrarie, ma forse anche la consapevolezza di trovarsi a est del meridiano di Tordesillas, e quindi in territorio portoghese, lo costrinsero a invertire la rotta. Passò davanti alla foce del Rio delle Amazzoni, dove notò che il mare in quel punto aveva acqua dolce, e si spinse fino all'isola di Trinidad, che disse popolata dai cannibali. L'insenatura protetta dall'isola, ovvero il Golfo di Paria, era invece abitata da gente mite e amichevole che favorì una sosta di circa due settimane. Il viaggio proseguì verso l'isola dei Giganti, a 15° di latitudine nord, e da lì verso Hispaniola, l'isola scoperta da Colombo, dove la flotta sostò per ben due mesi. Il viaggio di ritorno fu attraverso le Azzorre, ma il vento spinse le navi verso le Canarie, da dove fecero rientro a Cadice nel giugno del 1500.